分子克隆实验指南（原书第四版）（套装上中下册）

分子克隆技术30多年来一直是全球生命科学领域实验室专业技术的基础。冷泉港实验室出版的《分子克隆实验指南》一书拥有的可靠性和*性，使本书成为业内*流行、*具影响力的实验室操作指南。第四版的《分子克隆实验指南》保留了之前版本中备受赞誉的细节和准确性，10个原有的核心章节经过更新，反映了标准技术的发展和创新，并介绍了一些前沿的操作步骤。同时还修订了第三版中的核心章节，以突出现有的核酸制备和克隆、基因转移及表达分析的策略和方法，并增加了12个新章节，专门介绍*激动人心的研究策略，包括利用 DNA 甲基化技术和染色质免疫沉淀的表观遗传学分析、RNAi、新一代测序技术，以及如何处理数据生成和分析的生物信息学，例如介绍了分析工具的使用，如何比较基因和蛋白质的序列，鉴定多个基因的常见表达模式等。本书还保留了必不可少的附录：包括试剂和缓冲液、常用技术、检测系统、一般安...

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分子克隆技术30多年来一直是全球生命科学领域实验室专业技术的基础。冷泉港实验室出版的《分子克隆实验指南》一书拥有的可靠性和*性，使本书成为业内*流行、*具影响力的实验室操作指南。第四版的《分子克隆实验指南》保留了之前版本中备受赞誉的细节和准确性，10个原有的核心章节经过更新，反映了标准技术的发展和创新，并介绍了一些前沿的操作步骤。同时还修订了第三版中的核心章节，以突出现有的核酸制备和克隆、基因转移及表达分析的策略和方法，并增加了12个新章节，专门介绍*激动人心的研究策略，包括利用 DNA 甲基化技术和染色质免疫沉淀的表观遗传学分析、RNAi、新一代测序技术，以及如何处理数据生成和分析的生物信息学，例如介绍了分析工具的使用，如何比较基因和蛋白质的序列，鉴定多个基因的常见表达模式等。本书还保留了必不可少的附录：包括试剂和缓冲液、常用技术、检测系统、一般安全原则和危险材料。任何使用分子生物学技术的基础研究实验室都将因拥有一册《分子克隆实验指南》而受益。本书可作为学习遗传学、分子细胞生物学、发育生物学、微生物学、神经科学和免疫学等学科的重要指导，可供生物学、医药卫生，以及农、林、牧、渔、检验检疫等方面的科研、教学与技术人员参考。

Originally published in English as Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Fourth Edition, by MichaelR.Green and Joseph Sambrook ? 2012 Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NewYork, USA? 2017 Science Press. Print in China.Authorized Simplified Chinese translation of the English edition ? 2012 Cold Spring Harbor LaboratoryPress. This translation is published and sold by permission of Cold Spring Harbor Laboratory Press, the owner of all rights to publish and sell the same.

目录
上册
章 DNA的分离及定量 1
导言 2
方案1 SDS碱裂解法制备质粒DNA：少量制备 9
方案2 SDS碱裂解法制备质粒DNA：大量制备 12
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目录
上册
章 DNA的分离及定量 1
导言 2
方案1 SDS碱裂解法制备质粒DNA：少量制备 9
方案2 SDS碱裂解法制备质粒DNA：大量制备 12
方案3 从革兰氏阴性菌（如Ecolz中分离DNA 15
方案4 乙醇法沉淀DNA 17
方案5 异丙醇法沉淀DNA 21
方案6 用微量浓缩机进行核酸的浓缩和脱盐 22
方案7 丁醇抽提法浓缩核酸 23
方案8 聚乙二醇沉淀法制备Ml3噬菌体单链DNA 24
方案9 Ml3噬菌体铺平板 27
方案 Ml3噬菌体液体培养 30
方案11 Ml3噬菌体双链（复制型）DNA的制备 32
方案12 利用有机溶剂分离纯化高分子质量DNA 35
方案13 用蛋白酶K和苯酚从哺乳动物细胞中分离高分子质量DNA 37
方案14 一步法同时提取细胞或组织中的DNA、RNA和蛋白质 43
方案15 从鼠尾或其他小样本中制备基因组DNA 46
替代方案：不使用有机溶剂从鼠尾分离DNA 48
替代方案：一管法从鼠尾中分离DNA 49
方案16 快速分离酵母DNA 50
方案17 凝胶电泳后使用溴化乙锭(EB)估算条带中DNA数量 52
方案18 利用Hoechst33258通过荧光分析仪估算DNA浓度 53
方案19 用PicoGreen定量溶液中的DNA 55
信息栏 56
章 DNA分析 62
导言 63
方案1 琼脂糖凝胶电泳 73
方案2 琼脂糖凝胶中DNA的染色检测 76
方案3 聚丙烯酰胺凝胶电泳 80
方案4 聚丙烯酰胺凝胶中DNA的染色检测 85
方案5 聚丙烯酰胺凝胶中DNA的放射自显影检测 86
方案6 碱性琼脂糖凝胶电泳 87
附加方案：碱性琼脂糖凝胶的放射自显影 90
方案7 成像：放射自显影和感光成像 91
方案8 用玻璃珠从琼脂糖凝胶中回收DNA 96
方案9 低熔点琼脂糖凝胶中DNA的回收：有机溶剂抽提法 98
方案 聚丙烯酰胺凝胶中DN段的回收：压碎与浸泡法 1
方案11 Southern印迹 3
方案12 Southern印迹：DNA从一块琼脂糖凝胶同时向两张膜转移 1
方案13 采用放射性标记探针对固定在膜上的核酸DNA进行Southern杂交 112
附加方案：从膜上洗脱探针 117
信息栏 119
第3章 质粒载体克隆与转化 122
导言 123
方案1 制备和转化感受态大肠杆菌的Hanahan方法：高效转化策略 126
方案2 制备和转化感受态大肠杆菌的Inoue方法：“感受态”细胞 131
方案3 大肠杆菌的简单转化：纳颗粒介导的转化 135
替代方案：一步法制备感受态大肠杆菌：在同一溶液中转化和储存细菌细胞 136
方案4 电穿7L法转化大肠杆菌 138
方案5 质粒载体克隆：定向克隆 143
方案6 质粒载体克隆：平末端克隆 145
方案7 质粒DNA的去磷酸化 148
方案8 向平末端DNA添加磷酸化衔接子／接头 150
方案9 克隆PCR产物：向扩增DNA的末端添加限制性酶切位点 151
方案 克隆PCR产物：平末端克隆 154
方案11 克隆PCR产物：制各T载体 157
方案12 克隆PCR产物：TA克隆 159
方案13 克隆PCR产物：TOPO TA克隆 161
方案14 使用X-Gal和IPTG筛选细菌菌落：a-互补 165
信息栏 167
第4章 Gateway重组克隆 205
导言 206
方案1 扩增Gatewav载体 2
方案2 制备可读框入门克隆和目的克隆 213
方案3 应用多位点LR克隆反应制备目的克隆 219
信息栏 222
第5章 细菌人工染色体及其他高容量载体的应用 223
导言 224
方案1 BAC DNA的小量分离和PCR检验 235
方案2 BAC DNA的大量制备和线性化 238
方案3 通过脉冲电场凝胶电泳检验BAC DNA的质量和数量 241
方案4 两步BAC工程：穿梭载体DNA的制备 242
方案5 A同源臂(A-Box)和B同源臂(B-Box)的制备 244
方案6 克隆A和B同源臂到穿梭载体 247
方案7 重组穿梭载体的制备和检验 249
方案8 通过电穿7L法转化重组穿梭载体到感受态BAC宿主细胞 251
方案9 共合体的检验和重组BAC克隆的筛选 253
方案 一步BAC修饰：质粒制备 256
方案11 A同源臂(A-Box)的制备 259
方案12 克隆A同源臂到报道穿梭载体 260
方案13 用RecA载体转化BAC宿主 263
方案14 转移报道载体到BACiRecA细胞以及共合体的筛选 265
方案15 酿酒酵母(S.cerevisiae)的生长和DNA制备 267
方案16 酵母DNA的小量制备 269
信息栏 270
第6章 真核细胞RNA的提取、纯化和分析 275
导言 276
方案1 从哺乳动物的细胞和组织中提取总RNA 279
替代方案 从小量样本提取RNA 281
方案2 从斑马鱼胚胎和成体中提取总RNA 282
方案3 从黑腹果蝇提取总RNA 283
方案4 从秀丽隐杆线虫中提取总RNA 285
方案5 从酿酒酵母菌中采用热酸酚提取总RNA 287
方案6 RNA定量和储存 289
方案7 RNA的乙醇沉淀 295
方案8 通过无RNase的DNaseI处理去除RNA样品中的DNA污染 297
方案9 oligo(dT)磁珠法提取poly(A) mRNA 298
方案 按照大小分离RNA：含甲醛的琼脂糖凝胶电泳 308
方案11 根据分子质量大小分离RNA: RNA的尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 312
方案12 琼脂糖凝胶中变性RNA的辖膜和固定 319
替代方案 下行毛细管转移 323
方案13 聚丙烯酰胺凝胶的电转移和膜固定 325
方案14 Northern杂交 327
方案15 纯化RNA的点杂交和狭缝杂交 330
方案16 用核酸酶Sl对RNA作图 342
方案17 核糖核酸酶保护分析：用核糖核酸酶和放射性标记的RNA探针对RNA作图 349
方案18 引物延伸法分析RNA 355
信息栏 359
第7章 聚合酶链反应 363
导言 364
方案1 基础PCR 375
方案2 热启动PCR 380
方案3 降落PCR 383
方案4 高GC含量模板的PCR扩增 385
方案5 长片段高保真PCR (IA PCR) 390
方案6 反向PCR 393
方案7 巢式PCR 397
方案8 mRNA反转录产物cDNA的扩增：两步法RT-PCR 400
方案9 由mRNA的5'端进行序列的快速扩增：5'-RACE 409
方案 由mRNA的3'端进行序列的快速扩增：3 '-RACE 416
方案11 使用PCR筛选克隆 422
信息栏 424
第8章 生物信息学 431
导言 432
方案1 使用ucsc基因组浏览器将基因组注释可视化 434
方案2 使用BLAST和ClustalW进行序列比对和同源性检索 444
方案3 使用Primer3Plus设计PCR引物 450
方案4 使用微阵列和RNA-seq进行表达序列谱分析 461
方案5 将上亿短读段定位参考基因组上 472
方案6 识别ChIP-seq数据集中富集的区域（寻峰） 483
方案7 发现顺式调控基序 495
信息栏 503
中册
第9章 实时荧光聚合酶链反应定量检测DNA及RNA 509
导言 5
方案1 实时PCR反应用引物和探针浓度的优化 532
方案2 制作标准曲线 537
方案3 实时荧光PCR定量检测DNA 540
方案4 实时荧光PCR定量检测RNA 542
方案5 实时荧光PCR实验数据的分析和归一化 545
信息栏 550
第章 核酸平台技术 551
导言 552
方案1 即制微阵列 560
方案2 Round AiRoundB DNA扩增 564
方案3 核小体DNA和其他小于500bp的DNA的T7线性扩增(TIAD) 567
方案4 RNA的扩增 572
方案5 RNA的Cvanine-dUTP直接标记 578
方案6 RNA的氨基烯丙基-dUTP间接标记 581
方案7 用Klenow酶对DNA进行Cyanine-dCTP标记 583
方案8 DNA的间接标记 585
方案9 封闭自制微阵列上的多聚赖氨酸 587
方案 自制微阵列的杂交 589
1章 DNA测序 595
导言 596
方案1 毛细管测序质粒亚克隆的制备 620
方案2 毛细管测序之PCR产物的制备 625
方案3 循环测序反应 627
方案4 全基因组：手工文库制备 630
方案5 全基因组：自动化的无索引文库制备 636
附加方案 自动化的文库制备 642
方案6 全基因组：自动化的带索引文库制备 644
方案7 用于Illumina测序的3kb末端配对文库的制备 651
方案8 用于Illumina测序的8kb末端配对文库的制备 659
附加方案 AMPure磁珠校准 671
方案9 RNA—Seq:RNA反转录为cDNA及其扩增 673
附加方案 RNACleanⅪ’磁珠纯化/RNA—Seq前） 679
方案 液相外显子组捕获 680
附加方案 AMPure XP磁珠纯化 688
附加方案 琼脂糖凝胶大小筛选 689
方案11 自动化大小筛选 690
方案12 用SYBR Green-qPCR进行文库定量 693
方案13 用PicoGreen荧光法进行文库DNA定量 696
方案14 文库定量：用Qubit系统对双链或单链DNA进行荧光定量 700
方案15 为454测序制备小片段文库 702
方案16 单链DNA文库的捕获及emPCR 708
方案17 Rochei454测序：执行一个测序运行 714
方案18 结果有效性确认 721
方案19 测序数据的履量评估 723
方案20 数据分析 724
信息栏 725
2章 哺乳动物细胞中DNA甲基化分析 729
导言 730
方案1 DNA亚硫酸氢盐测序法检测单个核苷酸的甲基化 735
方案2 甲基化特异性聚合酶链反应法检测特定基因的DNA甲基化 742
方案3 基于甲基化胞嘧啶免疫沉淀技术的DNA甲基化分析 745
方案4 高通量深度测序法绘制哺乳动物细胞DNA甲基化图谱 749
方案5 亚硫酸氢盐转化的DNA文库的Roche454克隆测序 760
方案6 亚硫酸氢盐转化的DNA文库的Illumina测序 765
信息栏 770
3章 标记的DNA探针、RNA探针和寡核苷酸探针的制备 775
导言 776
方案1 引物法：用寡核苷酸延伸法标记纯化的DN段 792
方案2 引物法：在融化琼脂糖存在下用寡核苷酸延伸法标记DNA 798
方案3 用切口平移法标记DNA探针 800
方案4 用聚合酶链反应标记DNA探针 804
附加方案 不对称探针 808
方案5 体外转录合成单链RNA探针 809
附加方案 用PCR法将噬菌体编码的RNA聚合酶启动子加DN段上 816
方案6 用寡核苷酸引物法从mRNA合成cDNA探针 818
方案7 用寡核苷酸延伸法制备放射性标记的消cDNA探针 820
方案8 用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段标记双链DNA的3' 端 825
方案9 用碱性磷酸酶进行DN段的去磷酸化 831
方案 含5'突出羟基端的DNA分子磷酸化 833
方案11 去磷酸化的平端或5'凹端DNA分子的磷酸化 836
方案12 用T4多核苷酸激酶进行寡核苷酸5'端的磷酸化 839
方案13 用末端脱氧核苷酸转移酶标记寡核苷酸3'端 841
替代方案 用TdT合成放射性标记的探针 843
附加方案 加尾反应 843
附加方案 合成放射性标记探针的修饰 844
方案14 用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段标记合成的寡核苷酸 845
方案15 用乙醇沉淀法纯化标记的寡核苷酸 849
方案16 用空间排阻层析法纯化标记的寡核苷酸 850
方案17 用Sep-PakCl8柱色谱法纯化标记的寡核苷酸 852
方案18 寡核苷酸探针在水溶液中杂交： 在含季铵盐缓冲液中洗涤 854
信息栏 857
4章 体外诱变方法 871
寻言 872
方案1 用易错DNA聚合酶进行诱变 879
方案2 重叠延伸PCR产生插入或缺失诱变 890
方案3 以双链DNA为模板的体外诱变：用DpnI选择突变体 897
方案4 突变型B一内酰胺酶选择法定点诱变 904
方案5 通过单一限制性位点消除进行寡核苷酸指导的诱变/USE诱变） 9
方案6 利用密码子盒插入进行饱和诱变 915
方案7 扫描诱变 922
方案8 多位点定向诱变 926
方案9 基于PCR的大引物诱变 930
信息栏 933
5章 向培养的哺乳动物细胞中导入基因 937
导言 938
方案1 阳离子脂质介导的DNA转染 942
替代方案 采用DOTMA和DOGS进行转染 948
附加方案 单层细胞组织化学染色检测B一半乳糖苷酶 950
方案2 磷酸钙介导的质粒DNA转染真核细胞 952
替代方案 磷酸钙介导的质粒DNA高效转染真核细胞 956
方案3 磷酸钙介导的高分子质量基因组DNA转染细胞 959
替代方案 磷酸钙介导的贴壁细胞的转染 962
替代方案 磷酸钙介导的悬浮生长细胞的转染 963
方案4 DEAE-葡聚糖介导的转染：高效率的转染方法 964
替代方案 DEAE-葡聚糖介导的转染：提高细胞活力的方案 966
方案5 电穿孑L转染DNA 968
方案6 通过alamarBlue法分析细胞活力 972
方案7 通过乳酸脱氢酶法分析细胞活力 974
方案8 通过MTT法分析细胞活力 977
信息栏 980
6章 向哺乳动物细胞中导入基因：病毒载体 998
导言 999
方案1 直接克隆法构建重组腺病毒基因组 1 019
方案2 将克隆的重组腺病毒基因组释放用于挽救和扩增 23
方案3 氯化铯梯度沉降法纯化重组腺病毒 28
方案4 限制性内切核酸酶消化法鉴定纯化后的重组腺病毒基因组 31
方案5 TCID50终点稀释结合qPCR测定重组腺病毒感染滴度 34
附加方案 准备qPCR的DNA标准品 42
方案6 浓缩传代和Real-Time qPCR法检测有复制能力腺病毒(RCA) 43
方案7 瞬时转染法制备rAAV 51
方案8 氯化铯梯度沉降法纯化rAAV 54
方案9 碘克沙醇梯度离心法纯化rAAV 59
方案 肝素亲和层析法纯化rAAV2 62
方案11 阴离子交换柱层析法从碘克沙醇梯度离心后的rAAV样本中富集装病毒 65
方案12 实时定量PCR法测定rAAV基因组拷贝数 68
方案13 TCID50终点稀释结合qPCR法灵敏测定rAAV惑染滴度 71
方案14 负染色法和高分辨电子显微镜分析rAAV样本形态 74
方案15 银染SDS-PAGE分析rAAV纯度 76
方案16 高滴度反转录病毒和慢病毒载体的制备 79
方案17 慢病毒载体的滴定 85
方案18 监测慢病毒载体储备液中的可复制型病毒 89
信息栏 91
下册
7章 利用报道基因系统分析基因表达调控 12
导言 13
方案1 哺乳动物细胞提取物中B一半乳糖苷酶的测定 1112
附加方案 化学发光实验检测B一半乳糖苷酶活性 1115
方案2 单萤光素酶报道基因实验 1118
方案3 双萤光素酶报道基因实验 1123
方案4 酶联免疫吸附试验定量检测绿色荧光蛋白 1128
方案5 用四环素调控基因表达建立细胞系 1131
附加方案 有限稀释法筛选悬浮细胞的稳定克隆 1138
信息栏 1140
8章 RNA干扰与小RNA分析 1170
导言 1171
方案1 双链siRNA制备 1185
方案2 通过转染双链siRNA在哺乳动物细胞中进行RNA干扰 1187
方案3 通过转染双链siRNA在果蝇S2细胞中进行RNA干扰 1190
方案4 体外转录法制备dsRNA 1192
方案5 采用dsRNA浸泡果蝇S2细胞进行RNA干扰 1196
方案6 采用dsRNA转染在果蝇S2细胞中进行RNA干扰 1198
方案7 小RNA的Northern杂交分析 1199
方案8 反转录定量PCR分析小RNA 1203
方案9 构建小RNA高通量测序文库 1206
方案 抑制miRNA功能的反义寡核苷酸制备 1215
方案11 在哺乳动物细胞中通过反义寡核苷酸抑制miRNA功能 1216
方案12 在果蝇S2细胞中通过反义寡核苷酸抑制miRNA功能 1218
信息栏 1219
9章 克隆基因的表达以及目的蛋白的纯化和分析 1225
导言 1226
方案1 在大肠杆菌中利用可用IPTG诱导的启动子表达克隆化基因 1249
附加方案 目标蛋白可溶性表达的小量试验 1255
替代方案 在大肠杆菌中利用阿拉伯糖BAD启动子表达克隆基因 1260
替代方案 信号肽融合虽白的亚细胞定位 1261
方案2 用杆状病毒表达系统表达克隆基因 1265
附加方案 噬菌斑测定法确定杆状病毒原液的滴度 1271
替代方案 用于转染昆虫细胞的杆粒DNA制备 1274
方案3用 甲醇诱导启动子AOX1在毕赤酵母中表达克隆基因 1277
附加方案 酵母培养物的冻存 1287
方案4 用于纯化大肠杆菌中表达可溶性蛋白的细胞提取物的制备 1291
附加方案 酵母细胞玻璃珠裂解法 1296
替代方案 温和的热诱导的酶裂解法制备大肠杆菌细胞提取物 1298
替代方案 用溶菌酶裂解和冻融法联用制备大肠杆菌细胞提取物 1300
方案5 采用固化的金属亲和层析纯化多聚组氨酸标记的蛋白质 1302
附加方案 Niz -NTA树脂的清洗与再生 1309
替代方案 组氨酸标签蛋白的快速液相色谱纯化 13
方案6 采用谷胱甘肽树脂以亲和层析纯化融合蛋白 1314
方案7 含体中表达蛋白的增溶 1321
方案8 蛋白质的SDS-PAGE 1325
替代方案 用考马斯亮蓝进行SDS-PAGE凝胶染色的各种不同方法 1335
替代方案 用银盐进行SDS-PAGE凝胶染色 1336
方案9 蛋白质的免疫印迹分析 1340
方案 测定蛋白质浓度的方法 1347
信息栏 1353
0章 利用交联技术分析染色质结构与功能 1358
导言 1359
方案1 甲醛交联 1369
方案2 制备用于染色质免疫沉淀的交联染色质 1371
方案3 染色质免疫沉淀(ChIP) 1373
方案4 染色质免疫沉淀-定量聚合酶链反应( ChIP-qPCR) 1377
方案5 染色质免疫沉淀-芯片杂交（ChIP-chip） 1378
方案6 染色质免疫沉淀-高通量测序(ChIP-seq) 1385
方案7 交联细胞3C文库的制备 1389
方案8 环形染色质免疫沉淀（ChIP-loop）文库的制备 1393
方案9 连接产物对照组文库的制备 1398
方案 PCR检测3C、ChIP-loop和对照文库中的3C连接产物：文库滴定与相互作用频率分析 1400
方案11 3C、ChIP-loop和对照组文库的4C分析 1404
方案12 3C、ChIP-loop和对照组文库的5C分析 1408
信息栏 1412
1章 紫外交联免疫沉淀(CLIP)技术进行体内RNA结合位点作图 1415
导言 1416
方案1 CLIP实验免疫沉淀严谨性的优化 1424
方案2 活细胞的紫外交联和裂解物制备 1429
方案3 RNA酶滴定、免疫沉淀及SDS-PAGE 1432
方案4 3'-接头的连接祁用SDS-PAGE进行大小选择 1441
替代方案 去磷酸化RL3接头5端的标记 1445
方案5 RNA标签的分离、5二接头的连接和反转录PCR扩增 1446
方案6 RNA CLIP标签测序 1456
方案7 RNA接头胶回收及保存 1458
信息栏 1460
2章 Gateway相容酵母单杂交和双杂交系统 1464
导言 1465
方案1 构建酵母单杂交DNA-诱饵菌株 1474
替代方案 用复性引物从DNA诱饵中获得入门克隆产物 1481
方案2 生成酵母双杂交DB-诱饵菌株 1484
方案3 从活化域捕获文库中鉴定相互作用分子 1490
方案4 高效的酵母转化 1496
方案5 用于B-半乳糖苷酶活力的菌落转移比色测定 1500
方案6 酵母克隆的PCR 1502
信息栏 1504
附录1 和缓冲液 1507
附录2 常用技术 1533
附录3 检测系统 1541
附录4 一般安全原则和危险材料 1565
索引 1573
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